balita

Ang IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) usa ka analogue sa substrate nga β-galactosidase, nga labi ka madasig.Ubos sa induction sa IPTG, ang inducer mahimong maporma ang usa ka komplikado nga adunay repressor nga protina, Aron ang pagpahiuyon sa protina sa repressor mausab, aron dili kini mahiusa sa target nga gene, ug ang target nga gene gipahayag nga epektibo.Busa unsaon pagtino ang konsentrasyon sa IPTG sa panahon sa eksperimento?Ang mas dako ba mas maayo?
Una, atong sabton ang prinsipyo sa IPTG induction: Ang lactose operon (elemento) sa E. coli adunay tulo ka structural genes, Z,Y, ug A, nga nag-encode sa β-galactosidase, permease, ug acetyltransferase, matag usa.Ang lacZ nag-hydrolyze sa lactose ngadto sa glucose ug galactose, o ngadto sa allo-lactose;Ang lacY nagtugot sa lactose sa palibot nga moagi sa cell lamad ug mosulod sa selula;Ang lacA nagbalhin sa acetyl group gikan sa acetyl-CoA ngadto sa β-galactoside, nga naglakip sa pagtangtang sa Toxic effect.Dugang pa, adunay usa ka operating sequence O, usa ka pagsugod nga han-ay P ug usa ka regulatory gene I. Ang I gene code usa ka repressor protein nga makagapos sa posisyon O sa operator sequence, aron ang operon (meta) gipugngan ug gipalong.Adunay usab usa ka binding site alang sa catabolic gene activator protein-CAP binding site upstream sa initiating sequence P. Ang P sequence, O sequence ug CAP binding site nga magkauban naglangkob sa regulatory region sa lac operon.Ang coding genes sa tulo ka enzyme gi-regulate sa parehas nga regulatory region aron makab-ot ang coordinated expression sa gene products.

Kung wala ang lactose, ang lac operon (meta) naa sa kahimtang sa pagpanumpo.Niini nga panahon, ang lac repressor nga gipahayag sa I sequence ubos sa kontrol sa PI promoter sequence nagbugkos sa O sequence, nga nagpugong sa RNA polymerase sa pagbugkos sa P sequence ug nagpugong sa transcription initiation;kung naa ang lactose, ang lac operon (meta) mahimong maaghat Niini nga operon (meta) nga sistema, ang tinuod nga inducer dili lactose mismo.Ang lactose mosulod sa selyula ug ma-catalyzed sa β-galactosidase aron ma-convert sa allolactose.Ang ulahi, ingon usa ka molekula sa inducer, nagbugkos sa protina sa repressor ug nagbag-o sa pagkaporma sa protina, nga nagdala sa pagbulag sa protina sa repressor gikan sa pagkasunod-sunod nga O ug transkripsyon.Ang Isopropylthiogalactoside (IPTG) adunay parehas nga epekto sa allolactose.Kini usa ka kusgan kaayo nga inducer, nga wala gi-metabolize sa bakterya ug lig-on kaayo, mao nga kaylap nga gigamit sa mga laboratoryo.

Giunsa mahibal-an ang kamalaumon nga konsentrasyon sa IPTG?Tagda ang E. coli ingong pananglitan.
Ang E. coli BL21 genetically engineered strain nga adunay positibo nga recombinant pGEX (CGRP/msCT) gisudlan sa LB liquid medium nga adunay sulod nga 50μg·mL-1 Amp, ug gi-culture sa tibuok gabii sa 37°C.Ang kultura sa ibabaw gisudlan sa 10 ka botelya nga 50mL nga presko nga LB liquid medium nga adunay sulud nga 50μg·mL-1 Amp sa ratio nga 1:100 alang sa kultura sa pagpalapad, ug kung ang kantidad sa OD600 0.6 ~ 0.8, gidugang ang IPTG sa katapusan nga konsentrasyon.Kini mao ang 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Pagkahuman sa induction sa parehas nga temperatura ug parehas nga oras, ang 1 mL nga solusyon sa bakterya gikuha gikan niini, ug ang mga selula sa bakterya gikolekta pinaagi sa centrifugation ug gipailalom sa SDS-PAGE aron analisahon ang impluwensya sa lainlaing mga konsentrasyon sa IPTG sa ekspresyon sa protina, ug dayon pilia ang konsentrasyon sa IPTG nga adunay pinakadako nga ekspresyon sa protina.
Pagkahuman sa mga eksperimento, makit-an nga ang konsentrasyon sa IPTG dili ingon kadako kutob sa mahimo.Kini tungod kay ang IPTG adunay usa ka piho nga pagkahilo sa bakterya.Ang sobra nga konsentrasyon makapatay usab sa selula;ug sa kinatibuk-ang pagsulti, nanghinaut kami nga ang mas matunaw nga protina nga gipahayag sa selula, mas maayo, apan sa daghang mga kaso kung ang konsentrasyon sa IPTG taas kaayo, usa ka dako nga kantidad sa paglakip ang maporma.Lawas, apan ang gidaghanon sa matunaw protina mikunhod.Busa, ang labing angay nga konsentrasyon sa IPTG kasagaran dili mas dako ang mas maayo, apan mas ubos ang konsentrasyon.
Ang katuyoan sa induction ug cultivation sa genetically engineered strains mao ang pagdugang sa abot sa target nga protina ug pagpakunhod sa gasto.Ang pagpahayag sa target nga gene dili lamang apektado sa kaugalingon nga mga hinungdan sa strain ug sa ekspresyon nga plasmid, apan usab sa ubang mga kondisyon sa gawas, sama sa konsentrasyon sa inducer, ang temperatura sa induction ug ang oras sa induction.Busa, sa kinatibuk-an, sa wala pa ipahayag ug putli ang usa ka wala mailhi nga protina, labing maayo nga tun-an ang oras sa induction, temperatura ug konsentrasyon sa IPTG aron mapili ang angay nga mga kondisyon ug makuha ang labing kaayo nga mga resulta sa eksperimento.